La técnica del silopreno un nuevo procedimiento para el examen de vesica penis y bursa copulatrix

R. Magro

Resumen

      En este trabajo se describe un nuevo procedimiento para la preparación de genitalias internas de insectos (vesica penis + bursa copulatrix) evaginadas o expandidas. La necesidad de examinar la estructura tridimensional de las diversas partes de la genitalia interna, especialmente en especies de identidad taxonómica incierta, obliga a utilizar procedimientos que a menudo encierran cierta dificultad técnica. Aquí se presenta el método denominado 'técnica del silopreno', mediante el que se obtiene excelentes resultados tanto en montaje como en la observación de vesicas y bursas, permitiendo su estudio tridimensional desde cualquier ángulo.

PALABRAS CLAVE: Vesica penis, bursa copulatrix, preparación, técnica del silopreno.

The 'siloprene technique' a new procedure for preparing vesica penis and bursa copulatrix.

Abstract

      This work describes a new procedure for preparing expanded and everted internal genitalia (vesica penis + bursa copulatrix) of Insecta. There is a need for accurate exmination of three-dimensional structure of the different parts of the genitalia, particulary in species where taxonomic status is uncertain. This has lead to variety of techniques which are often difficult to implement. Here a simple method for mounting vesicas and bursas is presented, called the 'siloprene technique'. It produces excellent results, enabling observation of the three-dimensional structure from all angles.

KEY WORDS: Vesica penis, bursa copulatrix, preparation, siloprene technique.

 

Introducción

      El estudio de las armaduras genitales en los insectos tiene gran valor para la correcta determinación de las especies. A pesar de la información que proporcionan las distintas partes de la armadura genital externa, los patrones específicos resultan, algunas veces, insuficientes para la correcta determinación, especialmente en aquellas especies de mayor variabilidad morfológica y en aquellos grupos de especies cuya genitalia externa es muy similar. Se pueden poner numerosos ejemplos sobre lepidópteros; en la familia Lasiocampidae, donde existe gran parecido entre ginopigios de Malacosoma franconica (Esper, 1784) y M.alpicola (Staudinger, 1817); o en Noctuidae, casos como el de Euxoa (Euxoa) tritici (Linnaeus, 1761) y Euxoa (Euxoa) crypta (Dadd,1927), en los que las valvae de los machos son extremadamente difíciles de distinguir, aunque se puede aplicar un baremo estadístico, no demasiado seguro, basándose en la mayor o menor longitud de la extensión del sacculus y del harpa (véase FIBIGER, 1990: 33-36). En dichos casos se hace particularmente necesario el estudio de la genitalia interna.

HARDWICK (1950, 1958, 1965 y 1970) desarrolló la técnica para evaginar vesicas. Dicho autor consolidó la importancia del estudio de las mismas, que otros, por ejemplo McDUNNOUGH (1944), por cita alguno, estudiase sin evaginar (véase EICHLIN & CUNNINGHAM, 1978). Finalmente se basó en las ideas de PETERSEN (1907), concernientes a la hipótesis de la 'llave y la cerradura' (véase YELA, 1992: 40-41). Otros autores han profundizado en el estudio de la técnica para evaginar y han realizado completos estudios sobre anatomía: BERIO (1991), FIBIGER (1990), HACKER & MOBERG (1989), HOLLOWAY (1989), LAFONTAINE (1986 y 1987), LAFONTAINE & MIKKOLA (1987), MATTHEWS (1991), RONKAY & RONKAY (1987), RONKAY & VARGA (1989), YELA (1992) (para más detalles consúltese bibliografía en ellos citada).

      Por otro lado, la técnica clásica de preparación de genitalias internas no es sencilla, requiriendo un cierto entrenamiento y experiencia para ser llevada a cabo correctamente. De lo contrario, con frecuencia puede conducir a resultados defectuosos, originándose imágenes distorsionadas de vesica y bursa que pueden confundir y llevar a conclusiones erróneas. Por ello, hemos intentado otras técnicas alternativas de preparación, con excelentes resultados en la que hemos denominado 'técnica del silopreno', que se describe en este trabajo.

      A nuestro juicio, es particularmente importante el examen de la genitalia antes de proceder a su deshidratación y montaje. Por otra parte, como ya han señalado otros autores, consideramos que la conservación de los escleritos abdominales (abdomen abierto y extendido) es de gran importancia.

Material y métodos

Generalidades

      Como ha sido repetidamente mencionado en la bibliografía, el proceso tradicional de preparación de las genitalias, se divide en 5 fases: maceración, limpieza, tinción, deshidratación y montaje (véase por ejemplo VIVES MORENO, 1977 y 1988; SARTO I MONTEYS, 1984; SORIA CARRERAS, 1987; FERNÁNDEZ RUBIO, 1980 y YELA, 1992, por sólo mencionar algunos autores españoles que han trabajado en el tema; para más detalles consúltese la bibliografía en ellos citada). Como las cinco fases son sobradamente conocidas, a continuación sólo se indica aquello que puede ser original.

     Limpieza: tras la maceración, efectuamos una limpieza superficial con agua destilada y posteriormente, una más profunda con la siguiente solución:

Etanol, 15 cc., Ácido acético, 33 cc., Aguas destilada, 50 cc.

Tinción: utilizamos una técnica de doble tinción que facilita la visualización de estructuras de diversa consistencia, esclerosada, frágil y transparente. Preparamos dos soluciones colorantes y una aclarante de la siguiente manera:

Solución A: Azul de metileno, 2 gr., Verde diamante, 2 gr. , Agua destilada, 100 cc.

Solución B: Fucsina básica, 5 gr., Etanol, 10 cc., Agua destilada, 100 cc.

Solución aclarante: Etanol, 25 cc., Ácido acético, 20 cc., Agua destilada, 55 cc.

Se puede proceder de dos maneras:

a) Se sumergen las genitalias y el abdomen en la solución colorante A y, seguidamente, en la solución B, corrigiendo el exceso de tinción con la solución aclarante.

b) Teñimos con la solución colorante A, limpiamos y, seguidamente, introducimos las estructuras en la solución aclarante. De este modo, las partes conjuntivas adquieren un tenue color azul-verdoso y las más esclerosadas un fuerte color azul-violeta. Se aclaran y, a continuación, se introducen en la solución colorante B. Con ello, el tejido conjuntivo adquiere un fuerte color rosa, mientras que las zonas esclerosadas un fuerte color azul-violeta. Deshidratamos pasando las partes sucesivamente por alcoholes de diferente graduación: 36º, 50º, 100º, Etanol + Xileno (50%), Xileno + Entellán (50%) o Xileno + Eukit (50%), Xileno + Bálsamo de Canadá, o, si se incluye en Euparal, Alcohol isopropílico + Euparal (50%).

Montaje de preparaciones tradicionales: entre otras substancias se pueden utilizar bálsamo de Canadá, Depex, Euparal, Eukit , DMHF, Entellán, etc. El Depex y el Entellán reemplaza ventajosamente al bálsamo de Canadá, debido a que seca rápido a temperatura ambiente. El Euparal tiene un secado mucho más lento, pero permite preparaciones superiores a 1 milímetro de grosor (pero menores de 3 mm). Hay que rellenar periódicamente las preparaciones. El DMHF tiene la ventaja de que las preparaciones no necesitan deshidratarse, sin embargo, es fácil dejar burbujas.

Para la observación y toma de fotografías, se utilizó el microscopio estereoscópico Itorex SFC 11 A con el adaptador Kiowa/T2 par ala cámara Yashica 270 AF, 35 mm SLR. Empleamos película Ilford Fp-4, 60 ASA y/o Agfa Ortho, 25 ASA, revelándola con Rodinal, proceso D-46. Positivamos con la ampliadora Opemus 6 sobre papel Ilford Galerie, Ilford Ilfospeed RC, IS-1M, y/o Agfa RC-5. Todas las fotografías fueron realizadas, reveladas y positivadas por el autor.

Todo el material lepidopterológico utilizado para la realización del presente estudio se encuentra depositado en la colección del autor. Se examinaron 518 ejemplares de diversas especies y procedencias, 277 con preparación de vesicas y el resto con preparación de genitalias por métodos tradicionales.

 

Técnicas especiales para preparar genitalias internas

      Los autores citados en la introducción describen con todo detalle la técnica clásica de preparación de genitalias internas (vesica penis + bursa copulatrix), mediante deshidratación y fijación con alcohol isopropílico e inclusión en Euparal. Para la inyección del líquido fijador en la vesica o bursa, nosotros utilizamos una aguja dental de un bisel de 0'3 x 30 short, o la de 0'4 x 12 mm, o la denominada U-40 de 0'33 x 13 mm 29G x 1/2, pudiéndose usar jeringas dentales con cargador. Para determinados diámetros del edeago o el ductus bursae, menores de 0'3 mm, fabricamos capilares de fibra de vidrio incluso inferiores a 0,1 mm.

      El principal problema que se plantea es la sujeción del edeago, que normalmente cede a la presión que ejerce el agua o alcohol a salir por la aguja, pudiéndose estropear la preparación. Para subsanar dicho inconveniente, se pueden utilizar diversos tipos de agujas o minucias enmangadas trabajadas en forma de pequeño gancho. También se pueden fabricar artilugios, como el que nosotros utilizamos, que apresen el edeago por el exterior del coecum penis entre una serie de serie de piezas semicónicas que se adaptan al diámetro de una aguja situada en su interior.

      Para el montaje, dado el volumen y el grosor que adquieren las vesicas, se puede elevar el cubre con diferentes anillos de contención de P.V.C., aluminio, cristal, etc. Que se encolan el porta con Euparal, Entellán o cianocrilato fotopolimerizable. Las genitalias también se pueden almacenar en campanas Durhan, incluidas en glicerina o Silicex fluido.

 

Resultados

Finalidad de los ensayos

      Investigamos una nueva técnica para la evaginación de vesicas y expansión de bursas con el propósito de superar los inconvenientes que tiene la técnica tradicional (con isopropílico y Euparal).

      Dado nuestro particular interés por la familia Noctuidae, nos vimos obligados a estudiar un buen número de vesicas. A lo largo de un dilatado período de tiempo ensayamos distintas técnicas de evaginación al fin de lograr una presentación lo más perfecta posible del volumen en tensión de los diferentes divertículos vesicales. También ensayamos métodos de inclusión que permitieran un fácil manejo de vesicas y bursas bajo la lupa binocular, sin las limitaciones del montaje en porta. De ahí, que tuviéramos que buscar una substancia de relleno adecuada a nuestros objetivos, así como una forma de montaje no tradicional. La sustancia de relleno debía ser transparente, de baja densidad, de larga longevidad, no interactiva con la composición de las estructuras de las genitalias, resistente a los microorganismos, ácido y bases, aceites, etc., y estable; es decir, con las menores alteraciones, dilataciones, contracciones, reacciones químicas o calóricas en el período de reticulación o una vez inyectada y seca en el interior de la genitalia.

Substancias ensayadas

      A tal fin, y aparte de los ya mencionados alcilacrilatos, esencias y bálsamos, investigamos las propiedades y operatividad de las siguientes substancias: acetatos, alginatos, cianocrilatos, gomo-resinas, látex, plastómeros, poliésteres, resinas y siliconas (véase tabla I).

Tabla I. Tipos de substancias ensayadas para la preparación de genitalias internas

ACETATOS

RESINAS

Acrifix 93
Angola blanca
Plexigum 8050
Angola roja
ALCILACRILATOS
Aura
Dépex
Bagdad
Entellán
Bengala
Eukit
Brasil
ALGINATOS
Canadá, bálsamo
Lithocrón
Camerún
Xaltalgín
Colofonia
CIANOCRILATOS
Colombia
Ceyscristal
Congo
Ciano
Dammar
Ciano-exta
Demezcana
Instant-Automatic
Eleonis
Imedipén
Kaurí
Loctite
Kíssel
Pórex
Madagascar
CONPUESTOS DE ESENCIA
Manila
Euparal (= Diafane)
Mástic (= Almáciga pura)
GOMO RESINAS
Sandaraca
Almendras
Sierra Leona
Asafétida
Singapur
Basorina
Tolú, básamo de
Cerezina
Zancíbar
Galvani
SILICONAS
Goma arábica
Bayer B
Goma Euforí
Bayer 600F
Goma-guta
Ceys B
Goma-laca blanca
Ceys T
Goma-laca naranja
Orbasil B
Incienso
Orbasil T
Olivani
Silicex 58 B
Sagapeno
Silicex 58 T
Senegal
Siloprene-Rubber
Tragacanto
Silopreno
LÁTEX
Skillfraff B
Isopreno + elastómeros sintéticos
Skillfraff T
PLASTÓMEROS
Stanpalst B
Araldite Metal
Stanpalst T
Araldite Rápido
POLIÉSTERES
Araldite Standart
Lozano
Nural 20-109
R.opales
Nural 23
Félez-Maza
Paraloid
V-Plástic
Sitepox.358

      Existe abundante información sobre algunas de estas substancias en la bibliografía. De acuerdo con nuestros ensayos, algunas presentan ciertas ventajas (sobre todo las resinas epoxi y el isopreno + elastómeros sintéticos), pero también ciertos inconvenientes. En concreto las resinas epoxi son extremadamente duras e insolubles en substancias que no dañen el tejido conjuntivo de las genitalias internas. La mezcla de isopreno y elástómeros tiene una longevidad muy corta y se descompone en pocos años. Las siliconas, sin embargo, se han revelado como las substancias más adecuadas. Todas las investigadas tienen una dureza similar y una longevidad muy alta, siendo totalmente hidrófugas. Las B son blancas y opacas, las T son translúcidas. En contacto con la humedad atmosférica polimerizan, convirtiéndose en una especie de caucho muy flexible. También polimerizan bajo agua y otras substancias, como por ejemplo la glicerina, pero pierden su transparencia enturbiándose momentáneamente. El silopreno se presenta en pasta tixotrópica cuya temperatura de aplicación oscila entre -10º C y 40ª C, con un período de formación de piel de 5 minutos, a una temperatura de servicio de -40º C hasta 170º C. Sus características mecánicas sobre una lámina de 2 mm de espesor son las siguientes: dureza Shore A, 20; módulo de 100 % (Mpa), 0,35; resitencia a la rotura (Mpa), 1,6; alargamiento a la rotura (%) 500. Todas las siliconas, excepto Siloprene-Rubber, despiden durante el endurecimiento pequeñas cantidades de ácido acético. Nosotros realizamos el proceso bajo agua destilada, evitando posibles daños en los tejidos de la vesica y bursa, así como oxidaciones en las partes metálicas conservadas.

      Consideramos que el silopreno cumple con todos los requisitos exigidos, adaptándose con precisión a la forma natural de las vesicas evaginadas y a la de las bursas expandidas, siendo a la vez dúctil, translúcido, estable y longevo.

 

La técnica del silopreno

      Para evaginar la vesica procedemos de la manera clásica descrita en la bibliografía citada al principio de este trabajo. Antes de continuar, es conveniente observar detenidamente bajo lupa binocular las paredes de la vesica y su comportamiento bajo presión. Si está en perfecto estado la salida del líquido inyectado se producirá por el extremo distal de la vesica, es decir, el ductus vesicae. Para comenzar la introducción del silopreno, se deben de cumplir los siguiente requisitos:

  1. El edeago, con la vesica evaginada, debe de estar colocado en el interior de un pocillo histológico lleno de agua.
  2. La vesica no debe de tener burbujas.
  3. La aguja ha de estar barnizada con zapón o Copalite, debe tener la punta trabajada en ángulo recto y estar completamente llena de silopreno.
  4. El contenido de la jeringa no ha de tener burbujas.
  5. La jeringa será de las denominadas tipo 'Americano', en su defecto, la aguja se soldará fuertemente en la boca de la misma.

      Introducimos la aguja hasta el fondo de la cavidad vesical o ductus vesicae, superando ángulos y curvas, arrugando si es necesario la vesica en torno al capilar (Fig.15). Presionando el émbolo lentamente, de tal forma que el silopreno vaya introduciéndose por la vesica. Poco a poco se va haciendo resbalar la aguja en dirección al ductus ejeculatorius. Ciertas vesicas presentan el inconveniente de poseer divertículos de difícil acceso, en los que las burbujas se forman fácilmente y donde no llega a penetrar el silopreno. Solucionamos dicha dificultad realizando una pequeña incisión, con una minucia afilada y enmangada, en la parte más alta de cada divertículo. Para terminar limpiaremos el edeago, con su vesica evaginada, introduciéndolo en un tubo con agua o glicerina (Fig.16). De este modo quedará preparado todo el conjunto, es decir, la aguja en el interior del coecum penis y el ductus ejeculatorius y la vesica evaginada en su parte distal. A continuación soldaremos la base de la aguja a un tapón de corcho de 12 mm de diámetro. Para su almacenamiento empleamos tubos de 25 x 70 mm, pudiéndose conservar en húmedo o en seco.

      Sólo queda comentar que el tiempo necesario para desarrollar todo el proceso es aproximadamente de 8 minutos. Esta técnica permite la observación, así como la obtención de fotografías y dibujos desde cualquier ángulo (véanse Figs. 1-20).

      Para la preparación de bursas deben cumplirse los mismos requisitos reseñados anteriormente para la evaginación de vesicas. Concluido el relleno del corpus bursae, continuaremos con el cervix y ductus bursae. Los ginopigios así preparados se pueden conservar en campanas Durhan con glicerina (Figs. 18-19).

 

Discusión y conclusiones

Se han probado 79 substancias diferentes y se ha encontrado una, el silopreno, que cumple las condiciones requeridas para una preparación perfecta de las genitalias internas; esta técnica podría parecer compleja, pero es relativamente sencilla. En realidad, la dificultad se limita a la adquisición del instrumental necesario, así como a la de una cierta experiencia en su manejo. La técnica es en sí, más rápida que las conocidas hasta ahora, pero lo más destacable, es la claridad y precisión con que quedan presentadas las diversas partes estructurales de la vesica penis y bursa copulatrix. La posibilidad de estudiar los volúmenes en bulto redondo, es decir, permitiéndonos girarlos en cualquier sentido, abre nuevas perspectivas en el estudio de la arquitectura tridimensional de las genitalias internas. A la luz de los descubrimientos realizados por medio de esta técnica, se ha puesto en evidencia que la complejidad estructural de las vesicas evaginadas queda, hasta cierto punto enmascarada en las preparaciones en porta-objetos, en las que sólo se pueden examinar en norma lateral. El estudio de las genitalias internas, caso de que vayan a montarse en Euparal, debería llevarse a cabo antes del montaje, puesto que estructuras de cierta complejidad, presentes a veces en la zona basal de la vesica, pueden quedar escondidas una vez colocada la genitalia entre porta y cubre. La introducción en la genitalia interna de líquidos de suficiente densidad y su almacenamiento en tubos de cristal en la forma descrita, facilita el examen detallado de toda su extensión y volumen. Consideramos que el estudio de las vesicas en norma frontal, posterior, dorsal y ventral (Fig.20) es imprescindible.

      Desde el punto de vista taxonómico, somos de la opinión de que el estudio del aislamiento reproductivo entre especies, basado en el análisis funcional de la genitalia interna (hipótesis de la 'llave y la cerradura'), necesita de comparaciones exhaustivas en las que se ponga de relieve las diferencias entre las partes correspondientes de la genitalia femenina y masculina, fundamentalmente cervix bursae y vesica penis (véase YELA, 1992: 133-134). Es en este sentido en el que la técnica del silopreno puede revelarse como especialmente útil.

Agradecimiento

A Emilo Berio, Michael Fibiger, Fidel Fernández Rubio (por un consejo técnico extremadamente útil), Yolanda Manjarrés, Juan Carlos Estéban, Ana Mercado, Antonio Vives Moreno y José Luis Yela. A los evaluadores de este trabajo y los anteriores; a Cristina Esteban. Quede reflejado mi más sincero agradecimiento a todos cuantos he nombrado y a los que también apoyaron indirectamente este trabajo con sus publicaciones.

 

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Para consultar las láminas véase: SHILAP Revta. Lepid, 22(87): 200-206, 1994

Rafael Magro
rmagro@teleline.es

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